Physikalische Eigenschaften von HPLC Säulen

Für eine ideale Performance der Flüssigkeitschromatographie spielen neben den chemischen auch die physikalischen Eigenschaften der HPLC-Säule eine wichtige Rolle. Dazu zählen u.a. Länge, Innendurchmesser und Partikelgröße. Waren in den Anfangszeiten der Flüssigkeitschromatographie Säulen in nur wenigen, relativ großen Dimensionen erhältlich, ging in den letzten Jahren der Trend zu Säulen mit immer kleineren Dimensionen um die Trennleistung weiter zu erhöhen. Dazu wurden Innendurchmesser und Partikelgröße verringert, was jedoch durch den proportional steigenden Rückdruck limitiert wurde. Der Maximaldruck konventioneller HPLC-Anlagen liegt bei 400 bar.

Monolithische HPLC-Säulen

Um eine gesteigerte Trennleistung mit geringem Rückdruck zu vereinen, wurden monolithische Säulen entwickelt. Die ersten Säulen dieser Art waren ab dem Jahr 2000 kommerziell erhältlich. Monolithische Säulen sind, im Gegensatz zu konventionellen Säulen, nicht mit vollporösen Partikeln gepackt. Stattdessen bestehen sie aus einem porösen Kieselgelstab, der ein System aus Makro- und Mesoporen aufweist. Makroporen mit einer Größe von wenigen Mikrometern erhöhen die Permeabilität, so dass der Rückdruck deutlich niedriger ist. Mesoporen mit einer Größe von wenigen Nanometern erhöhen die Oberfläche und damit die Trennleistung. Monolithische HPLC-Säulen sind bis 200 bar stabil, können aber aufgrund ihrer Struktur mit sehr hohen Flussraten betrieben werden.

UHPLC-Säulen

Durch die Entwicklung der UHPLC mit geringeren Totvolumina und einem zulässigen Maximaldruck von nun mehr 1000 bar wurde eine weitere Reduzierung von z.B. Innendurchmesser und Partikelgröße ermöglicht und unerlässlich, um durch ein ideales Zusammenspiel zwischen UHPLC-Anlage und -Säule eine optimale Trennleistung zu erzielen. Es kamen die ersten sub2µm-Materialien auf den Markt, die die Trennleistung noch einmal deutlich steigerten (s.a. Evolution von HPLC-Säulen). Die neueste Entwicklung stellt die sogenannte Core-Shell-Technologie dar. Bei dieser werden die HPLC-Säulen nicht mehr mit vollporösem Material gepackt. Stattdessen werden Füllmaterialien verwendet, deren Partikel einen festen Kern aufweisen, welcher mit dem eigentlichen, porösen, Säulenmaterial ummantelt ist. Diese Technik ermöglicht durch kürzere Trennwege und dadurch verringerte Diffusionseffekte nochmals eine gesteigerte Effizienz der Trennleistung. Die optimale Flussrate bei Core-Shell-Phasen liegt höher als bei konventionellen Säulen bei gleichzeitig niedrigerem Rückdruck. Durch die Wahl einer entsprechenden Partikelgröße sind HPLC-Säulen mit Core-Shell-Partikeln daher auch für die konventionelle HPLC geeignet und können die Trennleistung auch bei diesen Anlagen noch einmal deutlich steigern.

Die richtige Säulendimension wählen

Die richtige Wahl der Säulendimension richtet sich nicht wie die Wahl des Säulenmaterials nach den Eigenschaften der / des Analyten, sondern nach dem Ziel, das Sie mit der Trennung verfolgen. Auch die HPLC-Hardware spielt hier eine wichtige Rolle. Entscheidende Fragen sind hierbei u.a.:

  • Arbeiten Sie (semi-)präparativ oder analytisch?
  • Wie viele Analyten sind in der Probe enthalten?
  • Arbeiten Sie mit einer HPLC oder einer UHPLC?
  • Ist Ihnen Zeit oder Auflösung wichtiger?
  • Welche Rolle spielt eine mögliche Lösemittelersparnis?
Beladbarkeit↓ abnehmend    

 

 

 

 

 

Empfindlichkeit

↑ abnehmend

 Säulen I.D. mm Typische Flussrate Typische Partikel-größe µm Technik Proben-mengemg Proben-volumenµl Totvolumen↓ abnehmend    

 

 

 

 

 

Eluentenersparnis

↑ abnehmend
> 20 > 150 ml/min 10 – 25 Präparativ ~200 200-3000
10 30 ml/min 5 – 10 Semi-präparativ ~30 30-500
3 / 4 / 4.6 0.6 – 1.2 ml/min 3 – 5 HPLC ~1-5 1-80
2 / 2.1 0.25 – 1 ml/min ≤ 1,x – 3 UHPLC ~0.2 0.2-5
1.0 40 µl/min ≤ 2 – 5 Micro LC ~0.05 0.05-1
0.2 4 µl/min ≤ 2 – 5 Kapillar LC ~0.03 1-3
< 0.1 200 nl/min ≤ 2 – 5 Nano LC ~0.01 1-3
Säulenlänge 200-300 mm 100-150 mm 30-100 mm 4-50 mm
Verwendung Komplexe Proben Adäquate Performance für die meisten Applikationen Schnelle Trennung Vorsäulen
  Auflösung                                                                            Analysengeschwindigkeit→ abnehmend                                                                                     ← abnehmend

Weiterlesen: